紫外檢測器高效液相色譜儀的檢定操作規程

1. 說明
1.1. 適用范圍：適用于具可變波長紫外檢測器的高效液相色譜儀的檢定。
1.2. 參照依據：國家技術監督局JJG705-2002“實驗室液相色譜儀檢定規程”、相關儀器操作說明書及中國藥典2005版二部附錄VD制定。
1.3. 儀器操作及環境條件：應符合相應儀器的操作及維護規程(SOP)。
2. 檢定項目和技術要求
2.1. 泵流量設定值誤差應Ss≤±2%；流量穩定性誤差應SR≤±2%。
2.2. 柱溫箱溫度設定值誤差ΔTs應不超過±2.0℃；柱溫箱溫度穩定性應不超過1.0℃。
2.3. 波長示值誤差應＜±2nm； 波長重復性應優于1nm。
2.4. 定性測量重復性誤差(5次定量環進樣)應RSD≤1.5%。
2.5. 定量測量重復性誤差(5次定量環進樣)應RSD≤1.5%。
2.6. 基線漂移應≤5×10-3(Au/h)，基線噪聲應≤5×10-4Au。
2.7. 最小檢測濃度應不超過4×10-8g/ml（萘的甲醇溶液）。
2.8. 梯度誤差Gc應不超過±3%（無梯度裝置不進行此項檢定）。
3. 檢定方法
3.1. 泵流量設定值誤差Ss，流量穩定性誤差SR的檢定
3.1.1. 儀器與用具
     分析天平   萬分之一      秒表       精度0.01秒     容量瓶     50ml
3.1.2. 操作程序
3.1.2.1. 將泵、進樣器、色譜柱和檢測器連接好，以甲醇為流動相。
3.1.2.2. 按表1設定流量，待流速穩定后，在流動相排出口用事先精密稱定過重量的容量瓶收集流動相，同時用秒表記錄，準確收集10～25分鐘，再精密稱定其重量。收集時間
應符合下表規定，每個設定值重復測定3次。
3.1.3. 結果計算
按下列公式計算SS和SR：
Fm=（W2-W1）/（P.t）
SS=（Fm-FS）/FS×100%
SR=(Fmax-Fmin)/F×100%
W2為容量瓶+流動相的重量(g)
W1為容量瓶的重量
P為實驗條件下的流動相密度(g/cm3)
t為收集流動相的時間(min)P
Fm流量實測值(ml/min)
FS流量設定值
Fmin同一組測量中流量最小值
Fmax同一組測量中流量最大值
F為同一組測量中流量的算術平均值
3.1.4. 結果判斷：SS和SR值應符合下表規定
流量設定值(ml/min)        0.5        1.0        1.5
測量次數        3        3        3
收集流動相時間(min)        25        15        10
允許誤差        SS        3%        2%        2%
        SR        3%        2%        2%
3.1.5. 注意事項:收集時間應將“秒”換算為“分”代入公式計算。
3.2. 柱溫箱溫度設定值誤差ΔTs、柱溫箱溫度穩定性Tc的檢定
3.2.1. 操作步驟：將溫度設為60℃，將一經過校正的溫度計放入柱溫箱內，每隔10min讀取溫度計顯示溫度與柱溫箱顯示溫度一次，共讀取7次，求出平均值。平均值與設定值之差為ΔTs，7次讀數中最大值與最小值之差為控溫穩定性Tc。
3.2.2. 結果判斷：柱溫箱溫度設定值誤差ΔTs應不超過±2.0℃；柱溫箱溫度穩定性應不超過1.0℃。
3.3. 波長示值誤差及波長重復性的檢定
3.3.1. 方法
3.3.1.1. 方法一
制備60ug/ml基準重鉻酸鉀的0.005mol/l硫酸溶液，用一節空管代替色譜柱將進樣器與檢測器連通，以水做流動相，流量為0.5～1.0ml/min，采用步進進樣法，即在235nm±5nm、257nm±5nm、313nm±5nm、350nm±5nm四個波段處，分別每2min改變1nm，用注射器注入5～10ul（或定量環）標準溶液，重復測量三次。記錄色譜圖。
3.3.1.2. 方法二
制備60ug/ml基準重鉻酸鉀的0.005mol/l硫酸溶液，按紫外分光光度法，用1cm石英比色皿分別在235nm±5nm、257nm±5nm、313nm±5nm、350nm±5nm四個波段處，以0.005mol/L硫酸為空白，測定各波長處60ug/ml基準重鉻酸鉀的0.005mol/l硫酸溶液的吸收度，各波長重復測量三次。
3.3.1.3. 方法三
對于儀器有波長準確度自檢功能的,可利用其自檢功能進行檢查，重復測量三次。具體詳見相關儀器操作說明書。
3.3.2. 結果計算：
最大（或最小）吸收點對應的波長與標準波長之差即為波長示值誤差。
三次測量平均值與三次測量值中最大差值即為波長重復性誤差。
3.3.3. 結果判斷：波長示值誤差應＜±2nm；波長重復性應優于1nm。
3.4. 基線漂移和基線噪聲的檢定
3.4.1. 色譜條件：
色譜柱：C18
流動相：甲醇
流速：1ml/min
波長：254nm
3.4.2. 操作步驟
將儀器各部份聯接好，將靈敏度設置為最靈敏檔，開機，以甲醇為流動相，待基線穩定后,記錄基線 10min，計算基線噪聲。
記錄基線 60min，計算基線漂移。
3.4.3. 結果計算：
Nd=KB
式中：    Nd--檢測器基線噪聲；
K--衰減倍數；
B--測得的基線峰-峰高對應的記錄儀標度，AU
基線漂移用1h內基線偏離原點的值（AU/h）表示。
3.4.4. 結果判斷：
基線漂移≤5×10-3(Au/h)
基線噪聲≤5×10-4Au
3.5. 最低檢測濃度的檢定
3.5.1. 對照品溶液的配制：用甲醇配制含萘4×10-8g/ml的甲醇溶液。
3.5.2. 色譜條件：
色譜柱：C18
流動相：甲醇
流速：1ml/min
波長：254nm
進樣量：20ul（定量環）
3.5.3. 操作步驟：將儀器各部份聯接好，以甲醇為流動相，開機，待基線穩定后，將上述配制好的對照品溶液進樣，記錄色譜圖。
3.5.4. 按下式計算最小檢測濃度：
              Cl=2?Nd?C/H
式中：Cl：最小檢測濃度（g/ml）；
Nd：基線噪聲峰-峰高，mm；
C：對照品溶液濃度（g/ml）；
H：標準溶液的色譜峰高，mm。
3.5.5. 結果判斷：對照品溶液的峰高應大于或等于兩倍基線噪聲峰高，即最低檢測濃度應低于4×10-8g/ml（萘的甲醇溶液）。
3.6. 梯度誤差的檢定
3.6.1.色譜條件
流動相：A為純水；B為0.1%丙酮水溶液
流速：1ml/min
波長：254nm
3.6.2. 操作步驟：將輸液泵和檢測器連接（不接色譜柱），開機后以溶劑A沖洗系統，基線平穩后開始執行下列梯度程序，記錄色譜圖。重復測量2次。
3.6.3. 梯度程序：

A：系統是色譜工作站控制的，按下表程序：
時間        流速        A%        B%
0 min        1ml/min        100%        0%
3 min        1ml/min        100%        0%
5min        1ml/min        80%        20%
8min        1ml/min        80%        20%
10min        1ml/min        60%        40%
13min        1ml/min        60%        40%
15min        1ml/min        40%        60%
18min        1ml/min        40%        60%
20min        1ml/min        20%        80%
23min        1ml/min        20%        80%
25min        1ml/min        0        100%
28min        1ml/min        0        100%
30min        1ml/min        100%        0
B：系統是梯度控制儀控制的，按下表程序：
時間        流速        A%        B%
0 min        1ml/min        100%        0%
3 min        1ml/min        100%        0%
5min        1ml/min        75%        25%
8min        1ml/min        75%        25%
10min        1ml/min        50%        50%
13min        1ml/min        50%        50%
15min        1ml/min        25%        75%
18min        1ml/min        25%        75%
20min        1ml/min        0        100%
23min        1ml/min        0        100%
25min        1ml/min        100%        0
3.6.4. 結果計算：
      
式中：
--第i段梯度誤差（%）；
--第i段輸出信號值平均值；
--各段輸出信號平均值的平均值。
3.6.5. 結果判斷：不超過±3%
3.7. 定性、定量測量重復性試驗
3.7.1. 色譜條件
色譜柱：C18
流動相：甲醇
流速：1ml/min
波長：254nm
進樣量：20ul（定量環）
3.7.2.操作程序
將儀器連接好，使之處于正常的工作狀態，待基線穩定后，用進樣閥的定量環注入20ul4×10-5g/ml萘的甲醇溶液或穩定的待分析樣品溶液，連續進樣5次，記錄萘的峰保留時間和峰面積。
3.7.3. 結果計算：

式中：
RSD%--定性（定量）測量重復性相對標準偏差；
Xi--第i次測得的保留時間或峰面積；
--5次測量結果的算術平均值；
i--測量序號。
3.7.4. 結果判斷
定性測量重復性誤差：5次峰保留時間相對標準偏差(RSD)應≤1.5%。
定量測量重復性誤差：5次峰面積相對標準偏差(RSD)應R≤1.5%。
4. 檢定周期
4.1. 法定檢定周期為1年。
4.2. 儀器維修或發現異常時應全面檢定一次。
4.3. 正常自檢按下表執行：
檢 定 項 目        周  期
泵流量設定值誤差、流量穩定性誤差        12個月
柱溫箱溫度設定值誤差ΔTs、柱溫箱溫度穩定性        12個月
波長示值誤差、波長重復性        12個月
基線噪聲及漂移        12個月
最小檢測濃度        12個月
梯度誤差Gc        12個月
定性、定量測量重復性誤差        12個月